Knockout Cell Lines

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CRISPR-U™-Knockout-Zelllinie
CRISPR-U™ (basiert auf CRISPR/Cas9 Technologie), die von Ubigene enwickelte, ist effizienter als allgemeine CRISPR/Cas9 beim Doppelstrangbruch. CRISPR-UTM kann die Effizienz der homologen Rekombination erheblich verbessern, und Knockout (KO), Punktmutation (PM, Point mutation) und Knockin (KI) in Vitro und in Vivo leicht erreichen. Mit CRISPR-UTM hat Ubigene die Gene der mehr als 100 Zelllinien erfolgreich bearbeitet.
CRISPR/Cas9 erkennt die Zielsequenzen mit gRNA, und leitet Cas9 Endonuklease den Upstream der PAM zu schneiden, was zum Doppelstrangbruch (DSB, double-strand break) der DNA in der Zielseite führen. Um den DSB zu reparieren, verwenden die Zelle ihren eigenen DNA Reparaturmechanismus, um die DNA-Sequenzteile durch Homologie-gesteuerte Reparatur (HDR, Homology Directed Repair) oder non-homologe Endverbindung (NHEJ, Non-Homologous End Joining ) hinzuzufügen, zu löschen oder zu ersetzen.Close
CRISPR-U™ (basiert auf CRISPR/Cas9 Technologie), die von Ubigene enwickelte, ist effizienter als allgemeine CRISPR/Cas9 beim Doppelstrangbruch. CRISPR-UTM kann die Effizienz der homologen Rekombination erheblich verbessern, und Knockout (KO), Punktmutation (PM, Point mutation) und Knockin (KI) in Vitro und in Vivo leicht erreichen. Mit CRISPR-UTM hat Ubigene die Gene der mehr als 100 Zelllinien erfolgreich bearbeitet.
Gene-editing Cases : 100 Types of Cell Lines

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Urinary System

Human bladder carcinoma cell line (TCCSUP)
Human bladder carcinoma cell line (5637)
Human Bladder Transitional Cell Carcinoma Cell Line (T24)
Human Adrenal Cortical Adenocarcinoma Cell Line
Mouse Mesangial Polyoma Cell Line
Rat Glomerular Mesangial Cell Line
Human Kidney Cell Line
Rhesus Monkey Kidney Cell Line
Human Renal Carcinoma CellLine
Human Embryonic Kidney Cell Line(HEK293)
Human Embryonic Kidney Cell Line(derived from 293)
Madin-Darby Canine Kidney Cell Line MDCK(NBL-2)
Human prostate carcinoma cell line (22RV1)

Blood and Lymphatic System

Mouse Macrophage Cell Line (RAW264.7)
Human Monocytic Cell Line (THP-1)
Human Erythroleukemia Cell Line
Human Leukemic Cell Line
Mouse Acute Myeloid Leukemia Cell Line
Mouse Myeloid Progenitor Cell Line
Rat Basophil Leukemia Cell Line (RBL-2H3)
Human leukemia cell line (HL-60)
Human T lymphocyte cell line (Jurkat, Clone E6-1)
Human myelogenous leukemia cell line (K-562)
Human caucasian histiocytic lymphoma cell line (U937)
Human B Cell Lymphoma Cancer Cell Line U2932
Human B Cell Lymphoma Cancer Cell Line OCI-LY3
Human Acute Non-B Non-T Lymphocytic Leukemia Cell Line (Reh)

Respiratory System

Human Bronchial Epithelial Cell Line (16HBE)
Human Lung Cancer Cell Line (A549)
Human Lung Cancer Cell Line (Calu-1)
Human Lung Cancer Cell Line (Epithelium)
Lewis lung carcinoma (LLC)
Human Non-small Cell Lung Carcinoma Cell Line (H1299)
Human Non-small Cell Lung Carcinoma Cell Line (HCC827)
Human Lung Adenocarcinoma Cell Line
Human Bronchial Epithelial Cell Line (BEAS-2B)
Human Bronchial Epithelial Cell Line
human embryonic lung fibroblasts
Human fetal lung fibroblast cell line (MRC-5)
Human hypopharyngeal carcinoma cell line (FaDu)
Human Lung Squamous Cell Carcinoma Cell Line NCI-H226
Human Small Cell Lung Cancer Cell Line H69AR
Chinese hamster lung cells (V79)

Endocrine System

Human Breast Cancer Cell Line (MDA-MB-231)
Rat Breast Cancer Cell Line (4T1)
Human Pancreatic Carcinoma Cell Line (PANC-1)
Human breast cancer cell line (MCF-7)
Human Breast Adenocarcinoma Cell Line (SK-BR-3)
Human Metastatic Pancreatic Adenocarcinoma Cell Line (AsPC-1)
Human Pancreatic Carcinoma Cell Line (MIA PaCa-2)
Human Pancreatic Carcinoma Tumor Cell Line
Mouse Pancreatic Carcinoma Cell Line (PANC-1)
Human Prostate Cancer Tumor Cell Line
Human prostate cancer cell line (PC3)
Human prostate cancer cell line (LNCaP)
Mouse Acinar Pancreatic Cell Line (266-6)
Human pancreatic cancer cell line (BxPC-3)
Human Breast Cancer Cell Line MDA-MB-468
Human Breast Cancer Cell Line MDA-MB-453
Human Breast Cancer Cell Line MDA-MB-436
Human Breast Cancer Cell Line ZR-75-1
Human Breast Cell Line MCF10A
Mouse Pancreatic Carcinoma Cell Line Capan-2
Human Ductal Carcinoma Cell Line BT-474
Human Prostate Cancer Cell Line VCaP

Circulatory System

Human Vulvar Leiomyosarcoma Cell Line
Rat Cardiac Myocytes (H9C2)
Human Coronary Artery Endothelial Cell line (HCAEC)
Mouse Myoblast Cell Line (C2C12)

Digestive System

Human Colon Cancer Cell Line (HCT116)
Human Colon Cancer Cell Line (SW480)
Human Colon Cancer Cell Line (SW620)
Human Colon Cancer Cell Line (HT-29)
Human Colon Cancer Cell Line (LoVo)
Human colon carcinoma cell line （RKO)
Human caucasian colon adenocarcinoma cell line (COLO 205)
Murine colorectal carcinoma cell line (CT26.WT)
Human colon adenocarcinoma cell line (DLD-1)
Human colorectal adenocarcinoma cell line (NCI-H716)
Human colorectal adenocarcinoma cell line (Caco-2)
Human colon carcinoma cell line （T84)
Human liver cancer cell line (Hep G2)
Human Hepatoma Cell Line (Hep3B)
Human hepatocellular carcinoma cell line (HuH-7)
Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line
Rat Hepatoma Cell Line
Rat Hepatoma Cell Line
Human Primary Colon Cancer Cell Lines
Human Gastric Cancer Cell Line (HGC-27)
Human gastric cancer cell line (AGS)
Human Esophageal Squamous Carcinoma Cell Line
Human Esophageal Squamous Carcinoma Cell Line (KYSE-150)
Human renal cell carcinoma cell line (786-O)
Porcine small intestinal epithelial cell line
Murine Colorectal Carcinoma Cell Line MCA38
Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line SNU-387
Human Gastric Cancer Cell Line SGC-7901
Human Esophageal Squamous Carcinoma Cell Line KYSE-150
Human Esophageal Squamous Carcinoma Cell Line KYSE-30
African green monkey kidney cell(Vero)

Skeleton, Articulus, Soft Tissue, Derma System

Human Osteosarcoma Cell Line (MG63)
Human bone osteosarcoma epithelial cell line (U-2 OS)
Human fibrosarcoma cell line (HT1080)
Human Osteosarcoma Cell Line
Immortalized Human Epidermal Cell Line
Mouse Chondrocyte Progenitor Cell Line
Ewing's Sarcoma Cell Line
Human Malignant Melanoma Cell Line
Human malignant melanoma cell line (A-375)
Murine melanoma cell line (B16-F10)
Human Melanoma Cell Line M14
Mouse myeloma cell line (Sp2/0-Ag14)

Ocular, Otolaryngologic and Oral System

Rat Muller Cell Line (rmc-1)
Human Tongue Squamous Carcinoma Cell Line
Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line (C666-1)
Human Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line (cne2z)

Brain and Nervous System

Human Neuroblastoma Cell Line (SK-N-SH)
Mouse neuroblastoma cell line (Neuro-2a)
Human Glioblastoma Cell Line (U251)
Rat Glioblastoma Cell Line (C6)
Human Glioblastoma Cell Line
Human glioblastoma cell line (U-87 MG)
Mouse Glioblastoma Cell Line GL261
Immortalize Human Microvascular Endothelial Cell Line hCMEC/D3
Mouse Hippocampal Neuron Cell Line HT22
Mouse Anterior Parietal Bone Cell Line (MC3T3-E1 Subclone 14)

Reproductive System

Human Cervical Carcinoma Cell Line (HeLa)
Human Ovarian Adenocarcinoma Cell Line
Mouse Embryonic Osteoblast Precursor Cells
Mouse Embryonic Fibroblasts (Preadipocytes)
Mouse Embryonic Fibroblasts (NIH/3T3)
Human Cervical Carcinoma Cell Line Hela 229
Human Cervical Squamous Cell Line SiHa
Human Ovarian Cancer Cell Line SK-OV-3
Human Ovarian Cancer Cell Line OVCAR3
Mouse Testicular Stromal Cell Line TM3
Chinese Hamster Ovary Cell Line (CHO-K1)

Knockout-Zelllinie
gRNA und Cas9 werden durch Virustransduktion oder Nukleofektion in die Zellen transferiert. Nach dem Wirkstoffscreening werden die Einzelklone erzeugt. Positive Klone werden durch Sequenzierung validiert.
Klassifikation der Genknockout-Zelllinie
Classifying Standards Klassifikation
Größe der Knockout-Sequenz Kurzfragment-Entfernung; Frameshift-Mutation; Großfragment-Entfernung
Methoden Virustransduktion; Nukleofektion
Zelltypen Tumorzellen; andere Zelllinien; IPS/ES usw.
Knockout-Strategien
Short fragment removalShort fragment removal

Kurzfragment-Entfernung. Führung-RNAs zielen auf die Introns der beiden Siten von Exon 2 und die Anzahl der Basen in Exon 2 ist kein Vielfaches von 3, was zu einer Mutation des Frameshifts führen kann.

Frame-shift mutationFrame-shift mutation

Frameshift-Mutation. Führung-RNA zielt auf das Exon, und die Anzahl der gelöschten Basen ist kein Vielfaches von 3. Nach dem Knockout würde die Frameshift-Mutation den Knockout eines Gens verursachen.

Large fragment removalLarge fragment removal

Großfragment-Entfernung. Vollständige Entfernung der kodierenden Sequenz, um einen Gen-Knockout zu erreichen.

CRISPR-U KO Strategy diagram
Workflow und Validierung
Work Flow and Validation
Case Study
Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO, chinese haster ovary) wurden als Wirtszellen bei der Herstellung einer Vielzahl von rekombinanten therapeutischen Proteinen verwendet, einschließlich monoklonaler Antikörper und Fc-Fusionsproteine. Wirtszellproteine (HCP, Host cell proteins) existieren Verunreinigungen, die aufgrund ihrer potenziellen Risiken für die Immunogenität aus therapeutischen Formulierungen entfernt werden müssen. Während der Großteil der HCP-Verunreinigungen in typischen nachgelagerten Reinigungsprozessen effektiv entfernt wird, bleibt die Beseitigung einer kleinen Population von HCP eine Herausforderung. Bei Verwendung des CRISPR/Cas9-Systems wurden Anxa2- und Ctsd-Knockout-CHO-Zelllinien erfolgreich establiert, und diese Studie bestätigte die vollständige Eliminierung des entsprechenden HCPs in Zelllysaten. Wichtig ist, dass alle Knockout-Zelllinien während 8-tägiger Kultivierung ein ähnliches Wachstum und eine ähnliche Lebensfähigkeit zeigten wie die Wildtyp-Kontrolle. Somit kann das Knockout nicht benötigter Gene die Kontamination mit HCP bei der Herstellung rekombinanter therapeutischer Proteine verringern.
（a）The constructed sgRNA targeted a unique sequence in exon 4 of the Anxa2 gene. The amplicon sequence was analyzed in both directions.
（a）Die konstruierte sgRNA zielte auf eine einzigartige Sequenz im Exon 4 des Anxa2-Gens ab. Die Amplikonsequenz wurde in beide Richtungen analysiert.
（b）The constructed sgRNA targeted the unique sequence in exon 2 of the Ctsd gene.<br> The amplicon sequence was analyzed in both directions.
(b) Die konstruierte sgRNA zielte auf eine einzigartige Sequenz im Exon 2 des Ctsd-Gens ab. Die Amplikonsequenz wurde in beide Richtungen analysiert.
The constructed sgRNA targeted the unique sequence in exon 2 of the Ctsd gene.The amplicon sequence was analyzed in both directions.
Charakterisierung der Proteinexpression aus CHO-Knockout-Zelllinien durch SDS-PAGE- und Western-Blot-Analyse. (a) Anxa2-Knockout-Zelllinien. (b) Ctsd-Knockout Zelllinien. Zellkultursüberstände und Zelllysate wurden in SDS-PAGE geladet. Gesamtproteine wurden durch CBB-Färbung nachgewiesen. Die Western-Blot-Analyse jedes Proteins wurde unter Verwendung der entsprechenden Nachweisantikörper durchgeführt. Das Sternchen kennzeichnet die unspezifische Bande. Das Doppelsternchen zeigt an, was wahrscheinlich ein Fragment von Cathepsin D ist.
Annexin A2 und Cathepsin D wurden in den Zellkultursüberständen oder -lysaten der entsprechenden Knockout-Zelllinien nicht nachgewiesen, was auf einen erfolgreichen Ausschluss dieser Verunreinigungen aus Wirtszellen für die therapeutische Proteinproduktion hindeutet. Zusätzlich wurde kein verkürztes HCP in der Proteinexpressionsanalyse der Anxa2- und Ctsd-Knockout-Zelllinien beobachtet.
Referenz:
Fukuda, N., Senga, Y., & Honda, S. (2019). Anxa2‐and Ctsd‐knockout CHO cell lines to diminish the risk of contamination with host cell proteins. Biotechnology progress, e2820.


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